Вірусологічна  лабораторія

 ДУ "Одеський обласний лабораторний центр
МОЗ України"

                               м. Одеса, Старосінна площа, 33
довідка  722-29-63, 725-22-10 ,725-22-65

                 

          

 

       Вирусологическая лаборатория Одесской областной санэпидстанции с 1988г. была одной из первых лабораторий Украины, в которой начали проводить тестирования на ВИЧ-инфекцию. В 1990г. под лабораторию выделяют новое помещение и с этого момента она получает новое название «Централизованная иммуно-вирусологическая лаборатория с диагностикой СПИДа и других особо-опасных вирусных инфекций». С 1998г. лаборатория  входит в состав Евросети лабораторий Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ).   С 1997г. лаборатория является референс по проведению подтверждающих исследований на ВИЧ-инфекцию для 9-ти скрининговых лабораторий по диагностике СПИДа в Одесской области, с 2003 года - по определению ВИЧ-статуса детей до 18 месяцев, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями.
    Чтобы получить право быть среди лучших лабораторий в стране, нужно было проделать огромную созидательную работу по организации, укреплению материально-технической базы и подготовки специалистов высокого творческого потенциала.
    На протяжении многих лет специалисты лаборатории учувствует в различных международных  проектах и грантах по профилактике и борьбе с ВИЧ-инфекцией. На данный момент лаборатория работает в проекте по выявлению случаев раннего инфицирования ВИЧ-инфекцией среди жителей  г. Одесса и Одесской области и по изучению качества экспресс-тестов различных производителей, которые используются в Украине для диагностики ВИЧ-инфекции.
    Немаловажную роль в проведении исследований и установлении ВИЧ-статуса пациента играют тест-системы, которые используются в лабораторной диагностике.
    Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относят к семейству ретровирусов  (Retroviridae), роду лентивирусов (Lentivirus). Название Lentivirus происходит от латинского lente — медленный. Такое название отражает одну из особенностей вирусов этой группы, а именно — медленную и неодинаковую скорость развития инфекционного процесса в макроорганизме. Для лентивирусов также характерен длительный инкубационный период. Попадая в организм, ВИЧ атакует определенные клетки крови: Т-лимфоциты-«помощники» или «хэлперы». Эти клетки играют важную роль в иммунной системе: они распознают различные чужеродные агенты (бактерии, вирусы, раковые клетки, токсины) - и отдают приказ другим клеткам уничтожить их. На поверхности этих лимфоцитов находятся молекулы СД-4, поэтому их называют также клетки СД-4. Вирус встречает клетку, на поверхности которой есть молекула СД-4. Оболочка вируса и клетки сливаются, и генетический материал вируса попадает в клетку, встраивается в ядро  и начинает управлять ею, пока клетка не погибает. К тому времени, когда ВИЧ-инфекция переходит в СПИД, уже миллиарды клеток крови содержат генетический материал вируса.
   
Для вируса иммунодефицита человека характерна высокая частота генетических изменений, возникающих в процессе самовоспроизведения.
   
В природе ВИЧ существует в виде множества квазивидов, являясь при этом одной таксономической единицей. В процессе исследования ВИЧ были обнаружены варианты, которые значительно отличались друг от друга по структуре генома. В современной классификации различают два основных типа — ВИЧ-1 и ВИЧ-2
.

Основные отличия:

Группа белков

ВИЧ-1

ВИЧ-2

Белки оболочки вируса (env)

гп 160 кд, 120 кд, 41 кд

гп 140 кд, 105 кд, 36 кд

Белки сердцевины вируса (gag)

п 55 кд, 24 кд, 17 кд

п 56 кд, 26 кд, 18 кд

Ферменты вируса (pol)

п 66 кд, 51 кд, 31 кд

п 68 кд

Примечание: Молекулярный вес белков выражается в килодальтонах - кд, гп - гликопротеины, п - протеины.

И ВИЧ-1, и ВИЧ-2 вызывают серьёзный иммунодефицит, однако клиническое течение болезни несколько различается. Известно, что ВИЧ-2 менее патогенен и передается с меньшей вероятностью, чем ВИЧ-1. Вероятно, это связано с тем, что ВИЧ-2-инфекция характеризуется более низким числом вирусных частиц на миллилитр крови. Отмечено, что инфекция ВИЧ-2 обеспечивает носителю небольшую защиту от заражения ВИЧ-1. Однако описаны случаи двойной инфекции, причём заражение может происходить в любом порядке. Инфекция ВИЧ-2 реже заканчивается развитием СПИД. Есть сведения о несколько большей частоте развития саркомы Капоши, кандидоза ротовой полости и хронической лихорадки при ВИЧ-1/СПИД.
    При ВИЧ-2/СПИД чаще развивается энцефалит, хроническая или бактериальная диарея, серьёзные цитомегаловирусные инфекции.
   
С момента открытия вируса научно-исследовательские интитуты активно работали над методами диагностики ВИЧ, предназначенных как для исследовательских, так и для клинических целей.

    На тот момент еще не существовало способов лечения ВИЧ-инфекции. Также никто не знал, всегда ли у человека с ВИЧ развивается СПИД и через какое время это может произойти. Единственными медицинскими мерами было лечение оппортунистических заболеваний, которые появлялись, когда ослабевала иммунная система. Так что у людей не было мотивации, чтобы узнавать свой ВИЧ-статус.
    С появлением профилактики для предотвращения оппортунистических инфекций, а позднее - антиретровирусной терапии, цели тестирования изменились. Тесты на ВИЧ стали условием для лечения, и заодно, средством профилактики.
    Тестирование на антитела к ВИЧ существует с 1985 года. С того момента технология тестирования пережила значительную эволюцию: появилось много новых и усовершенствованных тест-систем, предназначенных как для исследовательских, так и для клинических целей. В настоящее время лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции основана на выявлении антител к ВИЧ, вирусных антигенов, а также, в особых случаях, выявлении вирусной РНК или ДНК. В научных целях применяется выделение ВИЧ из культуры зараженных клеток. За это время сменилось четыре поколения тест-систем для выявления антител к ВИЧ. С каждым новым поколением упрощался процесс тестирования, автоматизировался, тем самым минимизировалось влияние «человеческого фактора», также увеличивалась достоверность результата на более ранних сроках.
    При проведении до-тестового консультирования мы часто сталкиваемся с вопросами «тест-системы какого поколения вы используете и в чем их отличие?»
- Тесты I поколения
имели невысокую чувствительность и специфичность и позволяли определять лишь наличие антител только к   ВИЧ 1.
- В конце 80-х годов прошлого века появились тест-системы ИФА II поколения. Они, как и последующих поколений, определяли антитела, как к ВИЧ 1, так и к ВИЧ 2.
    В тестах I и II поколения для выявления антител к ВИЧ использовался лизированный или обработанный ультразвуком вирус, полученный в культуре, поэтому их называют лизатными. Они представляли опасность при работе с ними. Считается, что тесты II поколения могут выявить ВИЧ после 42 дней, а тест-системы I поколения- после 63 дней
    В тестах III и IV поколения используют в качестве антигенов искусственно созданные белки ВИЧ - рекомбинантные или пептидные. Частота ложноположительных результатов резко уменьшилась при использовании в качестве антигена не белков, выделенных из вируса, а рекомбинантных или пептидных, т.е. синтезированных in vitro с помощью методов генной инженерии.
    - Особенностью тестов III поколения являлось их способность определять антитела - иммуноглобулины разных классов: М (IgM) и G (IgG), что существенно улучшило раннюю диагностику ВИЧ-инфекции.
    - Современные тест-системы IV поколения начали использовать в конце 1990-х годов. Фактически, это те же тесты III поколения, но обладают способностью определять как антиген, так и антитела, что привело к тому, что их называют комбинированными тестами, и в их названии всегда указывается "Ag/Ab" и отличительной особенностью является способность определять антиген - основной белок сердцевины (ядра) ВИЧ р24. Определение антигена p24 позволяет определить наличие ВИЧ еще до выработки антител, что уменьшает "период окна" и дает возможность выявить вирус в острой стадии ВИЧ-инфекции. При этом при положительном результате не все тесты показывают, что именно выявлено - антитела или антиген, поэтому, хотя тест-системы способны выявить ВИЧ на начальной стадии, определить, как давно передался вирус с их помощью невозможно. Как правило, для тест-систем четвертого поколения в качестве обследуемого материала используется кровь, хотя в некоторых видах тестов возможно использование слюны. Хотя в США иногда используется слюна в качестве материала, такой подход в тестировании не является официально рекомендованным в обследовании населения.
    Чувствительность тест-систем IV поколения приближается к 100%. При оценке результатов обследования на ВИЧ необходимо учитывать наличие «периода окна». Это промежуток времени от момента заражения ВИЧ до момента, когда уровень маркеров ВИЧ (антител, антигенов) становится выше порога обнаружения. До того, как в организме выработаются антитела, у человека может быть ВИЧ, который может передаваться другим людям, но при этом стандартный тест на антитела к ВИЧ будет отрицательный. «Период окна» при применении первых тестов на ВИЧ составлял от 8 до 12 недель и более. Используемые в настоящее время для скрининга населения на антитела к ВИЧ тест-системы могут определить их наличие через 4 недели в большинстве случаев (60 - 65%), а через 12 недель - в 95% случаев. Из этого следует сделать несколько важных выводов:
    1.Проводить тестирование на ВИЧ сразу после возможного заражения нецелесообразно, поскольку антитела к ВИЧ ещё не появились. Исключение: необходимость официального подтверждения отсутствия ВИЧ-инфекции у пострадавшего на момент опасного контакта с ВИЧ (например, в случае укола иглой при выполнении медицинских вмешательств).
    2.Отрицательному результату тестирования на ВИЧ можно доверять только в случае, если тестирование было проведено не менее чем через три месяца с момента возможного заражения, при этом в течение трех месяцев, предшествующих данному тестированию, не было повторной рискованной ситуации.
    Тестирование на ВИЧ (скрининг) состоит из двухуровнего обследования человека. ВИЧ-инфекция подтверждается двумя разными тестами: скрининговым тестом ИФА ВИЧ и подтверждающим тестом. Сначала, при первичном обследовании, используются тест-системы с высокой чувствительностью, чтобы выявить как можно больше случаев ВИЧ-инфекции, снизить вероятность ложноотрицательных результатов. При этом, из-за высокой чувствительности скрининговые тесты могут давать ложноположительные (серопозитивные) результаты. Во второй проверке используется подтверждающий тест с высокой специфичностью, чтобы выявить и минимизировать ложноположительные результаты. В качестве подтверждающего метода используется иммунный блоттинг (ИБ). Если тест-системы ИФА ВИЧ выявляют суммарные антитела к белкам ВИЧ, то иммунный блотинг – к отдельным белкам. По результатам проведенного исследования пробы крови при получении положительного или сомнительного (неопределенного) результата лаборатория возвращает в организацию здравоохранения, направившую пробу крови для исследования, направление, в котором делается запись «анализ повторить». Это значит, что результат теста требует перестановки, но это еще не значит, что у человека ВИЧ. Необходимо повторно сдать кровь по паспорту или заменяющему его документу, удостоверяющему личность обследуемого, для того, чтобы исключить возможность использования по ошибке чужого образца. На направлении должно быть отмечено «повторно». Эта повторная проба крови доставляется в арбитражную или референс лабораторию и исследуется на ИФА тест-системах для одновременного обнаружения антител и антигенов – IV поколения. Если результат исследования отрицательный, значит первый тест был ложноположительным. При получении положительного или неопределенного результата пробу крови исследуют в подтверждающем тесте методом иммунного блоттинга. Результаты, полученные в подтверждающем тесте (ИБ), интерпретируются как положительные, неопределенные и отрицательные. Если он положительный, значит у человека и есть ВИЧ. Если отрицательный или неопределенный, то через 4 – 6 недель проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ в иммунном блоттинге. Если отрицательный результат – положительный результат в ИФА следует считать ложноположительным, у человека нет ВИЧ. Однако, такой результат скринингового теста следует называть «реактивным», а не «положительным», поскольку его необходимо подтверждать другим методом. Судя по данным лабораторной диагностики, чаще всего, ответы со статусом «реактивный», приходятся на беременных женщин и трупный матерал. Как видите, «момент истины» для ВИЧ может затянуться.
   
Особенность тест-системы четвертого поколения заключается в том, что в очень редких случаях
ИФА может дать как ложноотрицательный, так и ложноположительный результат. Ложноотрицательный результат ИФА возможен при свежем инфицировании, пока антитела к ВИЧ еще не выработались организмом больного.  Это связано с уровнем антигена p24, который начинает снижаться примерно через месяц после передачи вируса, а антитела, как правило, обнаруживаются именно в этот период времени. В очень редких случаях антиген p24 может быть не выявлен до момента, когда антитела будут выработаны в необходимом для обнаружения количестве. Самостоятельные тесты на антиген p24 более чувствительны, чем комбинированные тесты, поэтому с большей вероятностью они способны обнаружить ВИЧ-инфекцию в этот период времени. Ложноположительные результаты могут быть получены при обследовании больных хроническими заболеваниями и в некоторых других случаях. Поэтому при получении положительного результата ИФА его обязательно перепроверяют более чувствительными методами.
    На данный момент, для подтверждения подозрений на острую ВИЧ-инфекцию, рекомендуется тестирование на РНК ВИЧ (ПЦР, тест на вирусную нагрузку). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет определить непосредственно наличие вируса. При помощи ПЦР определяют количество свободных вирусов, циркулирующих в крови. Вирусная нагрузка показывает, насколько активно проявляет себя вирус в крови.  Тесты на вирусную нагрузку также могут давать ложноположительные результаты. Тем не менее, анализ данных исследований говорит, что вполне возможно достаточно точное определение острого периода: "Во время периода острой ВИЧ-инфекции тест на вирусную РНК показывает результат более 50 000 копий/мл. Было зарегистрировано три случая ложноположительных РНК-тестов на ВИЧ-1, но во всех случаях пациенты были бессимптомными и вирусная нагрузка была у них менее 2 000 копий/мл. Присутствие высокого титра РНК ВИЧ-1 (более 50 000 копий/мл) в отсутствие антител к ВИЧ позволяет диагностировать острую ВИЧ-инфекцию".
Также      существует еще несколько способов диагностики ВИЧ:
1. "Экспресс-тесты" на ВИЧ

Другой инновацией стали экспресс-тесты на ВИЧ. При использовании обычных тестов образец крови посылается в лабораторию, и в результате пациент может прождать неделю прежде чем получить результат. Экспресс-тесты делаются на месте, и результат можно получить в течение получаса. Как и в случае с ИФА, положительный результат нуждается в подтверждающем тестировании иммунным блотингом.
    Преимущества экспресс-тестов в том, что они исключают ситуацию, когда пациент не возвращается за результатом. В анонимных кабинетах тестирования на ВИЧ уровень не возвращающихся пациентов довольно низок, но в таких учреждениях как клиники по лечению ИППП, около 30% пациентов не приходят, чтобы узнать результат.
Экспресс-тесты показали такую же точность, как и ИФА, при условии, что они выполняются осторожно и квалифицированным персоналом. Возможность совершения технической ошибки для таких тестов, как ни парадоксально, выше, потому что процедура кажется слишком простой, и пользователь может стать небрежным при его проведении. Чтобы решить эту проблему многие экспресс-тесты обладают сейчас
встроенными системами контроля, которые должны определить, соблюдена ли процедура тестирования. В США на данный момент одобрен только один экспресс-тест - Murex Diagnostics. При использовании экспресс-тестов врач осуществляет визуальный учет. При этом отсутствуют протоколированные документы и не исключен человеческий фактор при субъективной оценке результатов.

   2. ИФА тест-системы с пониженной точностью

В научных целях могут использоваться тест-системы ИФА, чья точность была намерено занижена. Такие тесты используются потому, что уровень антител после инфицирования следует определенной и предсказуемой схеме. Через 4-6 месяцев после передачи ВИЧ этот уровень резко поднимается, а затем достигает постоянного уровня - плато - который остается неизменным на протяжении многих лет.
    Современные тест-системы ИФА могут определить очень низкий уровень антител. ИФА с пониженной точностью больше используются не для диагностики среди пациентов, а их могут применять ученые и врачи, чтобы понять, произошла ли передачи вируса недавно, или это давняя инфекция. Если инфекция недавняя, то менее чувствительный тест, который становится положительным только к 6 месяцам, сможет это показать.
3.Тесты, не использующие кровь
     Раннее все тесты проводились на крови. Недавно были разработаны тест-системы для определения антител в слюне. Единственный оральный тест - OraSure, который был одобрен для применения в США, следует протоколу скрининга/подтверждения, как и другие тесты на ВИЧ. Это не совсем тест на слюну, для него используется небольшой соскоб жидкости с десен. Главное преимущества таких тестов - неинвазивная процедура, которая более комфортна для многих пациентов, а также такие тесты можно использовать в местах, где забор крови невозможен по санитарным или практическим соображениям




 




















3.    

 


                      http://civl.od.ua e-mail : civl@i.ua       jGASKO - 2019 (25.03.19)